berita

IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) ialah analog substrat β-galactosidase, yang sangat boleh diinduksi.Di bawah induksi IPTG, inducer boleh membentuk kompleks dengan protein penindas , Supaya konformasi protein penindas diubah, supaya ia tidak boleh digabungkan dengan gen sasaran, dan gen sasaran dinyatakan dengan cekap.Jadi bagaimanakah kepekatan IPTG harus ditentukan semasa eksperimen?Adakah lebih besar lebih baik?
Mula-mula, mari kita fahami prinsip induksi IPTG: Operon laktosa E. coli (elemen) mengandungi tiga gen struktur, Z,Y, dan A, yang masing-masing mengekod β-galactosidase, permease, dan acetyltransferase.lacZ menghidrolisis laktosa kepada glukosa dan galaktosa, atau menjadi allo-laktosa;lacY membenarkan laktosa dalam persekitaran melalui membran sel dan memasuki sel;lacA memindahkan kumpulan asetil daripada asetil-KoA kepada β-galaktosida, yang melibatkan penyingkiran kesan Toksik.Di samping itu, terdapat urutan operasi O, urutan permulaan P dan gen pengawalseliaan I. Kod gen I ialah protein penindas yang boleh mengikat kedudukan O jujukan operator, supaya operon (meta) ditindas dan tutup.Terdapat juga tapak pengikat untuk tapak pengikat protein-CAP pengaktif gen katabolik di hulu urutan permulaan P. Urutan P, jujukan O dan tapak pengikatan CAP bersama-sama membentuk kawasan kawal selia operon lac.Gen pengekodan ketiga-tiga enzim dikawal oleh kawasan pengawalseliaan yang sama untuk mencapai ekspresi produk gen yang diselaraskan.

Sekiranya tiada laktosa, lac operon (meta) berada dalam keadaan penindasan.Pada masa ini, penindas lac yang dinyatakan oleh jujukan I di bawah kawalan jujukan promoter PI mengikat kepada jujukan O, yang menghalang polimerase RNA daripada mengikat jujukan P dan menghalang permulaan transkripsi;apabila laktosa hadir, lac operon (meta) boleh diinduksi Dalam sistem operon (meta) ini, inducer sebenar bukanlah laktosa itu sendiri.Laktosa memasuki sel dan dimangkinkan oleh β-galaktosidase untuk ditukar kepada allolactose.Yang terakhir, sebagai molekul induser, mengikat kepada protein penindas dan mengubah konformasi protein, yang membawa kepada pemisahan protein penindas daripada urutan O dan transkripsi.Isopropylthiogalactoside (IPTG) mempunyai kesan yang sama seperti allolactose.Ia adalah inducer yang sangat kuat, yang tidak dimetabolismekan oleh bakteria dan sangat stabil, jadi ia digunakan secara meluas di makmal.

Bagaimana untuk menentukan kepekatan optimum IPTG?Ambil E. coli sebagai contoh.
Strain kejuruteraan genetik E. coli BL21 yang mengandungi pGEX rekombinan positif (CGRP/msCT) telah diinokulasi ke dalam medium cecair LB yang mengandungi 50μg·mL-1 Amp, dan dibiakkan semalaman pada suhu 37°C.Kultur di atas telah diinokulasi ke dalam 10 botol 50mL medium cecair LB segar yang mengandungi 50μg·mL-1 Amp pada nisbah 1:100 untuk budaya pengembangan, dan apabila nilai OD600 ialah 0.6~0.8, IPTG telah ditambah kepada kepekatan akhir.Ia adalah 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1.Selepas induksi pada suhu yang sama dan masa yang sama, 1 mL larutan bakteria diambil daripadanya, dan sel-sel bakteria dikumpulkan dengan sentrifugasi dan tertakluk kepada SDS-PAGE untuk menganalisis pengaruh kepekatan IPTG yang berbeza pada ekspresi protein, dan kemudian pilih kepekatan IPTG dengan ekspresi protein terbesar.
Selepas eksperimen, akan didapati bahawa kepekatan IPTG tidak sebesar mungkin.Ini kerana IPTG mempunyai ketoksikan tertentu kepada bakteria.Melebihi kepekatan juga akan membunuh sel;dan secara amnya, kami berharap bahawa lebih banyak protein larut yang dinyatakan dalam sel, lebih baik, tetapi dalam banyak kes apabila kepekatan IPTG terlalu tinggi, sejumlah besar kemasukan akan terbentuk.Badan, tetapi jumlah protein larut menurun.Oleh itu, kepekatan IPTG yang paling sesuai selalunya bukan lebih besar lebih baik, tetapi lebih rendah kepekatannya.
Tujuan induksi dan penanaman strain kejuruteraan genetik adalah untuk meningkatkan hasil protein sasaran dan mengurangkan kos.Ekspresi gen sasaran bukan sahaja dipengaruhi oleh faktor terikan sendiri dan ekspresi plasmid, tetapi juga oleh keadaan luaran yang lain, seperti kepekatan induktor, suhu aruhan dan masa aruhan.Oleh itu, secara amnya, sebelum protein yang tidak diketahui dinyatakan dan ditulenkan, adalah lebih baik untuk mengkaji masa aruhan, suhu dan kepekatan IPTG untuk memilih keadaan yang sesuai dan mendapatkan keputusan eksperimen yang terbaik.